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『猜你感兴趣』关于H9N2亚型禽流感

发布日期:2019-10-12 03:04   来源:未知   阅读:

  [1-2]。A 型流感病毒血凝素受体结合区与细胞表面唾液酸受体结合,是病毒感染宿主的第一步,也是决定病毒宿主感染谱的重要因素。HA 受体结合区(RBD)主要由130-loop 、190-helix 和220-loop 组成,是决定流感病毒组织嗜性和跨种传播的重要结构[3-4] 。对H9N2 亚型流感病毒HA 蛋白220-loop 区(222~228 位氨基酸)进行序列比对分析发现,226 位和227 位氨基酸变异相对较大,而其它位点保守性较高。本研究利用重叠PCR 技术,对H9N2 病毒Y280 亚系内的主要流行分支—S2-like 分支病毒A/Chicken/Jilin/DH102/2012 的226 位和227 位进行了氨基酸置换,应用反向遗传技术拯救定点突变病毒,通过固相酶联实验鉴定突变位点对病毒受体结合特性的影响。

  扩增H9N2 分离株A/Chicken/Jilin/DH102/2012 全基因组。针对HA 基因受体结合区RBD 的226 位、227 位设计突变引物,经重叠PCR 扩增含突变位点的HA 基因。通过同源重组获得病毒的八基因同源重组质粒,利用反向遗传技术拯救未突变与定点突变病毒,最后采用固相酶联实验鉴定重组病毒对人型及禽型受体的结合能力。

  固相酶联实验结果表明,HA226 为L,H9N2 病毒偏嗜结合人型受体;HA226 为Q,病毒偏嗜结合禽型受体;HA226 为M,病毒能够同时结合两种类型受体,但与人型受体结合更强;HA227 为Q,病毒偏嗜结合人型受体;HA227 为M,病毒仍然保持对人型受体的偏嗜性。尽管L226Q 、L 226M 、Q227M 突变对病毒的受体亲和性产生了不同程度的影响,但与227 位氨基酸相比,226 位氨基酸突变对病毒受体亲和性的影响更加显著。值得注意的是,226L 位点能够显著增加病毒对人型受体的亲和力,该位点是增强H9N2 病毒在哺乳动物间传播能力的潜在位点。

  本研究结果充实了对H9N2 病毒RBD 区不同氨基酸位点功能的认识,明确了226 和227 位在H9N2 病毒结合受体中的作用。

  刘青涛,李银,杨婧,赵冬敏,刘宇卓,韩凯凯,黄欣梅,毕可然,刘娜,田宇杰

  (江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014)

  H9N2 亚型禽流感病毒(AIVs )属于低致病性禽流感病毒,在临床上并不能像H5 和H7 高致病性禽流感病毒那样导致鸡的大批死亡[1 ,2] 。但是,H9N2 AIVs 感染却可以引起鸡的免疫抑制,进而导致疫苗的免疫失败或者其它病原的继发感染,是目前危害我国家禽养殖业的主要病原之一。然而,H9N2 AIVs 诱发免疫抑制的机理目前还不清楚。树突状细胞(DCs)是主要的专职抗原递呈细胞,并诱导T 细胞的活化、增殖,是启动获得性免疫应答的始动细胞[3, 4] 。此外,DCs 在调控宿主的先天性免疫应答中发挥关键作用,是连接先天性免疫和获得性免疫的“桥梁”在抗病毒免疫中发挥关键作,而病毒也往往通过感染DCs 或者调控DCs 的功能来抑制宿主的免疫应答,造成机体的免疫抑制[5]。因此,本文对DCs 感染H9N2 AIVs 后的转录组变化进行了研究。

  从鸡的股骨和胫骨中分离骨髓细胞,并用重组鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和重组鸡白细胞介素4(IL-4)在体外进行诱导培养,培养6 天后获得鸡的骨髓源树突状细胞,并对获得的树突状细胞的表面标志进行流式鉴定。同时,用H9N2 AIVs 感染DCs,感染12h 后收取细胞,提取总RNA,并对RNA 的质量进行测定,RNA 质量测定合格后制备cDNA 文库,通过接头序列固定在Flowcell 上进行桥式PCR 扩增,再用Illumina 测序仪进行深度测序,结合生物信息方法分析H 9N2 AIVs 感染所引起的DCs 基因表达谱的变化。

  鸡的骨髓细胞在体外诱导培养6 天后分化为树突状细胞,细胞表面表达高水平的CD11c 和MH C II 分子。将获得的树突状细胞感染H9N2 AIVs,12h 后收取细胞,并提取RNA,宣布湖南正式脱离国民党政府。九龙解码玄机图,经检测所提取的RNA 的RIN 值在7.1 以上,浓度在175ng/μl 以上,可用于Illumina 高通量测序。通过对原始测序数据的过滤、比对、注释和筛选发现,与非感染的DCs 相比,H9N2 AIVs 感染的DCs 存在6291 个差异表达基因,其中4152 个基因表达上调,2139 个基因表达下调。GO 功能分类结果显示这些基因主要富集于细胞膜、细胞外区、细胞外基质、内质网等,主要参与跨膜运输、离子转运、细胞基质组成、细胞黏附、受体介导的内吞作用等生物学过程,主要涉及肽酶活性、钙离子结合、水解酶活性、离子通道活性等分子功能。KEGG 分析表明这些差异表达基因主要参与细胞外基质受体相互作用、补体和凝血级联反应、吞噬小体、细胞因子与受体的相互作用、溶酶体等信号通路。

  本研究首次利用高通量测序技术分析了H9N2 AIVs 对树突状细胞在转录水平上的影响,为进一步揭示H9N2 AIVs 诱发树突状细胞功能调变的分子机制奠定了基础。今晚特马开奖结果查询以前我的头发非常

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